POMEN TOPNEGA RECEPTORJA ZA INTERLEVKIN-2 PRI SEPSI
Strokovni prispevek

Ključne besede: t-IL-2R; sepsa; časovna dinamika; diagnoza; prognoza

Izvleček - Izhodišča. Topni receptor za interlevkin-2 (t-IL-2R) sodi med topne citokinske receptorje in neposredno odraža množino receptorja za IL-2 na limfocitih T, ki je poleg IL-2 pomemben za specifični imunski odziv.
Namen naloge je bil dokazati diagnostično in prognostično vrednost t-IL-2R pri sepsi.

Bolniki in metode. V obdobju treh let smo pregledali 64 odraslih zdravih dajalcev krvi, ki so bili zajeti pri sistematičnih pregledih. Pregledali smo 50 odraslih bolnikov s kliničnimi znaki in laboratorijskimi kazalniki sepse, zdravljenih v enoti za intenzivno zdravljenje na Kliniki za infekcijske bolezni in vročinska stanja v Kliničnem centru v Ljubljani. t-IL-2R v serumu in plazmi smo merili s testi ELISA firme Eurogenetics (Belgija).

Rezultati. Dokazali smo, da je srednja vrednost koncentracije t-IL-2R pri septičnih bolnikih s pozitivno in negativno hemokulturo v primerjavi z zdravimi značilno višja (p < 0,05). Srednja vrednost koncentracije t-IL-2R je pri septičnih bolnikih, ki so umrli, značilno višja (p < 0,05) kot pri tistih, ki so preživeli. Srednja vrednost koncentracije t-IL-2R se pri septičnih bolnikih s pozitivno hemokulturo ne razlikuje v primerjavi s septičnimi bolniki z negativno hemokulturo. Srednja vrednost koncentracije t-IL-2R se pri sepsi, povzročeni z gram pozitivnimi in gram negativnimi povzročitelji, statistično značilno ne razlikuje. Časovno spreminjanje nam kaže povečane vrednosti
t-IL-2R v prvih 48 urah.

Zaključki. Koncentracija t-IL-2R je povečana pri odraslih septičnih bolnikih. Povečane vrednosti t-IL-2R so značilno povezane s smrtnostjo bolnikov.

Uvod

Odzivnost limfocitov T je odvisna od delovanja receptorskih beljakovin, ki vežejo IL-2 na površini celic. Njihova oblika je različna glede na afiniteto posameznih beljakovin do liganda. Razlikujemo tri polipeptidne verige: alfa (IL-2Ra), beta (IL-2Rb) in gama (IL-2Rg). IL-2Ra in IL-2Rb vežeta IL-2 s šibko afiniteto, vse tri verige pa tvorijo močno afinitetni receptor na membrani spodbujenih limfocitov T. Veriga alfa se v literaturi pojavlja z imenom antigen Tac (T cell activation antigen) ali CD25. To je eden od označevalcev aktivacije limfocitov T. Kodira ga en sam gen na kromosomu 10 (1-3). Vendar membranski IL-2R ni edina oblika tega receptorja, ki jo zaznamo pri procesu aktivacije. Aktivirani kloni limfocitov T in mononuklearni fagociti izločajo topno obliko antigena Tac brez transmembranskega in citoplazmatskega dela, ki ima manjšo molekulsko maso (40.000 do 45.000) kot na membrano vezani receptor. Afiniteta topnega receptorja za IL-2 (t-IL-2R) za vezavo z IL-2 je enaka kot pri šibko afinitetnem IL-2Ra. Omenjajo dva možna mehanizma sproščanja t-IL-2R:
- proteolitična odcepitev IL-2Ra s celične površine,
- izločanje proteina, ki nastane zaradi različnih začetnih mest pri prepisu gena za receptor ali različnih posttranskripcijskih modifikacij mRNK za ta receptor (4).
Vloga t-IL-2R ni jasna. Za nekatere topne citokinske receptorje je dokazana njihova zaviralna vloga pri imunskem sistemu (5), drugi spet kažejo zmožnost, da v kompleksu s citokinom izzovejo prenos signala v notranjost celice (6-8). Pri t-IL-2R so možne različne razlage, za nobeno pa ni dovolj trdnih dokazov. Kroemer meni, da bi bil lahko to stranski izdelek aktiviranih limfocitov T brez posebne vloge v imunskem odzivu (9). Raziskovalci, ki so se trudili dokazati, da ta topni receptor deluje zaviralno na učinkovanje IL-2 v in vivo in in vitro sistemih, so to dokazali le pri visokih koncentracijah topnega receptorja, ki pa jih v organizmu redko najdemo. Kljub temu menijo, da bi topni receptor lahko deloval kot inhibitor aktivnosti IL-2 in s tem uravnaval avtokrini učinek IL-2 (6, 10). Zaradi pomanjkanja neposrednega dokaza, da so topni receptorji inhibitorji IL-2, je Rubin s sodelavci prvi menil, da bi ta protein lahko deloval tudi kot nosilec IL-2 v zunajceličnem prostoru, pri stiku z močno afinitetnim receptorjem na membrani tarčne celice pa bi IL-2 zlahka prešel nanj. Temu mnenju se pridružujejo tudi drugi raziskovalci in menijo, da je IL-2, vezan na tak nosilec, zaščiten pred proteolizo (11).
Zdaj menimo, da je količina t-IL-2R v serumu kazalnik aktivacije imunskega sistema v organizmu, saj korelira z aktivnostjo procesa pri malignih in avtoimunskih boleznih, pri reakcijah zavrnitve presadka in pri različnih infekcijskih boleznih. V nizkih koncentracijah ga najdemo tudi v serumu in urinu pri zdravih ljudeh, koncentracija pa naraste deset- do stokrat pri naštetih boleznih. Z uspešnim zdravljenjem se tudi njegova koncentracija v serumu zniža (11, 12).

Namen

Namen naloge je bil dokazati, da je koncentracija t-IL-2R pri kontrolni skupini in pri septičnih bolnikih značilno različna. Iz razlik v koncentracijah t-IL-2R in s proučevanjem časovnega spreminjanja t-IL-2R smo poskušali dokazati njegovo diagnostično in prognostično vrednost pri sepsi.

Bolniki in metode

Bolniki
V našo prospektivno študijo smo vključili dve skupini preiskovancev.
V kontrolni skupini je bilo 64 zdravih dajalcev krvi obeh spolov in različne starosti (od 19 do 62 let). Zajeti so bili pri sistematičnih zdravstvenih pregledih. Imeli so anamnezo brez posebnosti in osnovne krvne preiskave (sedimentacija, število levkocitov, število eritrocitov, hemoglobin, diferencialno krvno sliko) v okviru normalnih vrednosti. Preiskovancem smo odvzeli kri za plazmo (v epruvete z antikoagulansom EDTA) in kri za serum (v epruveto brez antikoagulansa).
Drugo skupino je sestavljalo 50 odraslih bolnikov različne starosti s kliničnimi znaki in laboratorijskimi izvidi za sepso, zdravljenih v enoti za intenzivno zdravljenje na Kliniki za infekcijske bolezni in vročinska stanja v Kliničnem centru v Ljubljani. Bolnikom smo ob sumu na sepso odvzeli kri za hemokulturo in za citokine. Pri preučevanju časovnega spreminjanja t-IL-2R pri štirih septičnih bolnikih smo odvzeli kri ob postavljenem sumu na sepso in nato 1 uro, 2, 4, 8, 24, 36 in 48 ur po prvem odvzemu.

Metode

Klinični in laboratorijski parametri za diagnozo sepse
Pri bolniku s sumom na sepso smo ugotavljali naslednje klinične znake in laboratorijske parametre (Bonnovi kriteriji sepse): telesna temperatura več kot 38 oC ali manj kot 36 oC, srčni utrip, večji od 90 utripov na minuto, frekvenca dihanja več kot 20 vdihov na minuto ali Pa(CO2) manj kot 32 mmHg, hipotenzija, letargija in oligurija, število polimorfonuklearnih levkocitov (PMN) več kot 12 ž 109/l ali manj kot 4 ž 109/l, več kot 10% nezrelih levkocitov (13, 14). Bolnikom smo merili tudi CRP v serumu (CRP > 7 mg/l).

Metoda za hemokulturo VITAL
Septičnim bolnikom smo odvzeli kri za hemokulturo. Steklenice za aerobno in anaerobno rast smo vložili v avtomatizirani sistem za hemokulture VITAL (BioMerueux, Francija). Naprava temelji na zaznavanju CO2, spremembi pH in spremembi oksidoredukcijskega potenciala v steklenici. Te spremembe povzroča mikrobna rast v gojišču. Steklenice imajo vgrajeno posebno fluorescenčno kemikalijo. Računalnik zazna zmanjšanje fluorescence v steklenici in s tem prve znake mikrobne rasti tako, da lahko nemudoma začnemo z laboratorijskimi postopki kultivacije in identifikacije (15).

Merjenje koncentracije t-IL-2R
Koncentracijo topnih receptorjev v serumu in plazmi smo določevali z metodo ELISA z reagenti Eurogenetic (Belgija). Pri testih smo sledili navodilom proizvajalcev.

Statistična obdelava podatkov
Izračunali smo povprečne vrednosti (aritmetična sredina), standardne deviacije in značilne razlike med srednjimi vrednostmi t-IL-2R pri različnih skupinah (Studentov t-test in test c2) s programskim paketom Microstat (Ecosoft Inc.).

Rezultati

Srednja vrednost in standardna deviacija koncentracije t-IL-2R v plazmi kontrolne skupine je bila 77,20 + 35,70 E/ml. Srednja vrednost in standardna deviacija koncentracije t-IL-2R v serumu kontrolne skupine je bila 59,70 + 34,90 E/ml. Ugotovili smo, da se srednje vrednosti koncentracije t-IL-2R v plazmi in serumu statistično značilno ne razlikujeta (p > 0,05). Določili smo normalno koncentracijsko območje v serumu in plazmi za t-IL-2R. Normalno koncentracijsko območje smo izračunali tako, da smo srednjim vrednostim koncentracije t-IL-2R v plazmi in serumu kontrolne skupine prišteli in odšteli dve standardni deviaciji. Normalno koncentracijsko območje za t-IL-2R v plazmi, merjeno s testi ELISA (Eurogenetics), je od nezaznavnega do 148,60 E/ml, normalno koncentracijsko območje za t-IL-2R v serumu, merjeno s testi ELISA (Eurogenetics), je od nezaznavnega do 129,50 E/ml.
Dvajsetim septičnim bolnikom s pozitivno hemokulturo in 30 septičnim bolnikom z negativno hemokulturo smo izmerili koncentracijo t-IL-2R v plazmi. Izračunali smo srednje vrednosti t-IL-2R pri vseh septičnih bolnikih. Ugotovili smo, da je srednja vrednost koncentracije t-IL-2R pri septičnih bolnikih povečana v primerjavi z normalnimi vrednostmi (p < 0,01), pri bolnikih s pozitivno hemokulturo je trikrat višja (p < 0,01), pri bolnikih z negativno hemokulturo pa je štirikrat višja od zgornje meje normale (p < 0,01). Srednja vrednost koncentracije t-IL-2R se pri septičnih bolnikih z negativno hemokulturo in pri septičnih bolnikih s pozitivno hemokulturo značilno ne razlikuje (tab. 1).

Tab. 1. Koncentracija topnega receptorja za interlevkin-2 (t-IL-2R) v plazmi zdravih dajalcev (kontrolne skupine) in septičnih bolnikov s pozitivno in negativno hemokulturo: srednje vrednosti, standardne
deviacije in statistične razlike med skupinami.

t-IL-2R - topni receptor za interlevkin-2, X - srednja vrednost, SD - standardna deviacija, No - število vzorcev, HK - hemokultura, p - statistične razlike, NS - ni signifikantno

s-IL-2R - soluble interleukin-2 receptor, X - mean value, SD - standard deviation, No - number of samples, BC - blood culture, p - statistical differences, NS - not significant

Tab. 2. Koncentracija topnega receptorja za interlevkin-2 (t-IL-2R) v plazmi septičnih bolnikov, ki so preživeli, in septičnih bolnikov, ki so umrli: srednje vrednosti, standardne deviacije in statistične razlike
med skupinama.

t-IL-2R - topni receptor za interlevkin-2, X - srednje vrednosti, SD - standardne deviacije, No - število vzorcev, p - statistične razlike

s-IL-2R - soluble interleukin-2 receptor, X - mean values, SD - standard deviation, No - number of samples, p - statistical differences

Od 50 bolnikov s kliničnimi znaki sepse je umrlo šest bolnikov, ostali so preživeli. Ugotavljali smo, ali se koncentracija
t-IL-2R značilno razlikuje pri umrlih in pri preživelih. Izračunali smo srednjo vrednost koncentracije t-IL-2R pri umrlih in pri preživelih. Ugotovili smo, da je srednja vrednost koncentracije t-IL-2R statistično značilno višja pri umrlih kot pa pri preživelih (p < 0,01) (tab. 2).
Pri 20 septičnih bolnikih s pozitivno hemokulturo smo pri dvanajstih izolirali 13 gram pozitivnih bakterij (koagulaza negativni stafilokoki - 4, Staphylococcus aureus - 5, Staphylococcus epidermidis - 2, Streptococcus pneumoniae - 1, Streptococcus pyogenes - 1) in pri 8 gram negativne bakterije (Escherichia coli - 5, Klebsiella sp. - 1, Enterobacter - 1, Bacteroides fragilis - 1).
Ugotavljali smo, ali se koncentracija t-IL-2R razlikuje pri sepsi, povzročeni z gram pozitivnimi in gram negativnimi bakterijami. Izračunali smo srednje vrednosti koncentracije t-IL-2R pri sepsi, povzročeni z gram pozitivnimi in gram negativnimi bakterijami, in ugotovili, da se statistično ne razlikujeta (tab. 3).

Tab. 3. Koncentracija topnega receptorja za interlevkin-2 (t-IL-2R) v plazmi septičnih bolnikov z gram pozitivno in gram negativno sepso: srednje vrednosti, standardne deviacije in statistične razlike med sku-
pinama.

Zaključki

Merjenje topnih receptorjev za citokine v krvi ni standarden postopek, zato je treba za vrednotenje rezultatov pri bolnikih določiti normalno koncentracijsko območje. Normalno koncentracijsko območje za t-IL-2R v plazmi, merjeno s testi ELISA (Eurogenetics), je od nezaznavnega do 148,60 E/ml, normalno koncentracijsko območje za t-IL-2R v serumu, merjeno z istimi testi, je od nezaznavnega do 129,50 E/ml.
Pri določevanju citokinov v krvi bolnikov s kliničnimi znaki sepse smo dokazali, da je koncentracija t-IL-2R v plazmi značilno višja v primerjavi z zdravimi preiskovanci (X + SDzdravi = 77,2 + 35,7; X + SDbolni - poz HK = 460 + 262,34; X + SDbolni - neg HK = 694,68 + 807,42; p < 0,01).
Koncentracija t-IL-2R je bila pri bolnikih, ki so umrli, značilno višja kot pri bolnikih, ki so preživeli (X + SDpreživeli = 520,20 + 341,23; X + SDumrli = 1190,61 + 341,23; p < 0,01).
Pri primerjavi rezultatov med skupinama bolnikov s pozitivno in negativno hemokulturo smo ugotovili, da v koncentraciji t-IL2 R ni statististično značilnih razlik (X + SDbolni-pozHK = 460 + 262,34; X + SDbolni-negHK = 694,68 + 807,42).
Časovno spreminjanje ravni t-IL-2R kaže, da je koncentracija
t-IL-2R povečana v prvih 48 urah pri vseh štirih bolnikih.
Pri septičnih bolnikih, okuženih z različnimi povzročitelji, ni mogoče napovedati odziva t-IL-2R, ki bi bil značilen za gram pozitivne oziroma gram negativne bakterije.

Literatura

1. Leonard WJ, Depper JM, Robb RJ, Waldman TA, Green WC. Characterisation of the human receptor for T cell growth factor. Proc Natl Acad Si USA 1983; 80: 6057-60.
2. Robb RJ, Kutny RM. Structure-function relationships for the IL-2 receptor system. IV. Analysis of the sequence and ligand binding properties of soluble Tac protein. J Immunol 1987; 139: 855-62.
3. Bilač M. Interlevkin 2 in njegov specifični receptor v primarnih kulturah mononuklearnih celic. Diplomska naloga. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 1996.
4. Kosmina B, Lavrenčič A. Časovna odvisnost strjevanja interlevkina 2 in receptorja za interlevkin 2. Med Razgl 1992; 31: 151-63.
5. Kondo N, Kondo S, Shimizu A, Honjo T, Hamuro J. A soluble 'anchorminus' interleukin 2 receptor supress in vitro interleukin 2-mediated immune responses. Immunology Letters 1988; 299-308.
6. Dower SK, Smith CA, Park LS. Human cytokines receptors. Clin Immunol 1990; 10: 289-99.
7. Gillis S. Cytokine receptors. Curr Opin Immunol 1991; 3: 315-19.
8. Botran RF. Soluble cytokine receptors: their role in immunoregulation. FASEB J 1991; 5: 2567-74.
9. Kroemer G, Wich G. The role of interleukin 2 in autoimmunity. Immunol Today 1989; 10: 246-51.
10. Keystone EC, Show KM, Bombardier C, Chang C, Nelson DL, Rubin LA. Elevated soluble interleukin-2 receptor levels in the sera and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 844-9.
11. Rubin LA, Nelson DL. The soluble interleukin-2 receptor: biology, function and clinical application. Ann Int Med 1990; 113: 619-27.
12. Spear ML, Stefano JL, Fawcett, Proujansky R. Soluble interleukin-2 receptor as a predictor of neonatal sepsis. J Pediatr 1995; 126: 982-5.
13. Bone RC. Why new definition of sepsis and organ failure are needed. Am J Med 1993; 95: 348-50.
14. Vincent JL, Bihari D. Sepsis, severe sepsis or sepsis syndrome: need for classification. Intensive Care Med 1992; 18: 255-7.
15. VITAL. Procedures Manual. BioMerieux. Lyon: RCS.
16. Pokrajac T, Wraber B, Gubina M, Dragaš AZ, Koren S. Measurement of concentration of inflammatory cytokines and soluble interleukin-2 receptor in human blood. 4th International Congress on the Immune Consequences of Trauma, Shock and Sepsis (Proceedings Book). Munich, 1997: 7-11.
17. Dinnarello CA, Cannon JG. Cytokine measurements in septic shock. Ann Intern Med 1993; 119: 853-4.
18. Cannon JG, Nerad JL, Poutsiaka DD, Dinarello CA. Measuring circulating cytokines. J Appl Physiol 1993; 75: 1897-902.
19. Pokrajac T. Pomen citokinov TNF, IL-1b, IL-6 in t-IL-2R pri sepsi. Doktorska naloga. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 2000.
20. Karrer U, Aeschlimann L, Fassbender K et al. Interleukin-6, l"slicher Interleukin-2-Rezeptor (sIL-2R) und Microheterogenit"t des alpha-1 sauren Glykoproteins (AGP): neue Marker der Akut-Phase-Reaction? Schweiz Med Wschr 1992; 122: 233-6.
21. Delogu G, Casula MA, Maucini P, Tellan G, Signore L. Serum neopterin and soluble IL-2R for prediction of a shock state in gram negative sepsis. J Crit Care 1995; 10: 64-71.
22. Deng MC, Erren M, Kammerling L et al. The relation of interleukin-6, tumor necrosis factor-a, IL-2, and IL-2 receptor levels to cellular rejection, allograft dysfunction, and clinical events early after cardiac transplantation. Transplantation 1995; 60: 1118-24.